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565体育:刘耀光院士/祝钦泷研究员团队发表V型CRISPR/Cas12家族蛋白在植物基因组工程领域的前沿进展

来源单位及审核人:亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 黄庆生编辑:李彦华审核发布:曾子焉 发布时间:2024-05-31

  近日,我校亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室、生命科学学院和农学院刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在生物工程领域国际著名期刊Biotechnology Advances(影响因子16.0,中科院一区,生物工程领域排名4/158)在线发表了题为“The type V effectors for CRISPR/Cas-mediated genome engineering in plants”的研究综述。文中系统总结了V型效应蛋白(CRISPR/Cas12)的结构特征、新效应蛋白的挖掘方法、效应器的工程化改进策略,及其在动物和植物基因编辑中的应用发展,为CRISPR/Cas12在作物遗传改良和提高农业生产等方面的应用,提供了研究思路与有益的参考。  

  在众多CRISPR系统中,根据Cas效应蛋白的组成将CRISPR/Cas系统分Class Ⅰ和Class Ⅱ两类,根据其作用方式主要划分了六种类型 (Type Ⅰ—Ⅵ)。在两类CRISPR/Cas系统中,Class Ⅰ (Type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ)需要多个蛋白亚基组成复合体共同作用才能够发挥功能,而Class Ⅱ (Type Ⅱ, Ⅴ, Ⅵ) 则只需在单一Cas蛋白与相应向导RNA (guide RNA)介导下发挥针对核酸链的干扰功能(图1)。尽管目前已经挖掘并检测到多个CRISPR Cas系统能够在体外发挥DNA切割和操纵的能力,但是目前在真核细胞中能够高效作用系统仍旧只有SpCas9和AsCas12a,分别属于Class Ⅱ -Type Ⅱ和Class Ⅱ-Type Ⅴ。对比Cas9,Cas12拥有多样化的特性,使得Cas12家族表现出强大的应用潜力。

图1.各类CRISPR系统的特点及Type V CRISPR系统的系统发育树

A. CRISPR Class I和Class II基因座中元件的一般分布图

B. CRISPR系统中不同类型蛋白质所需的组分及其特性

C. CRISPR Class II type V家族的系统发育树,包括RuvC活性结构域的氨基酸 (Asp-Glu-Asp, DED) 

  为便于新进入该领域的研究工作者学习与使用,该综述详细介绍了目前Class II CRISPR基因编辑系统的效应蛋白和crRNA挖掘与确定的方法(图2),为挖掘更多的新V型效应蛋白提供了便利。

图2.Class II CRISPR系统的发现流程图

  Type V效应器的挖掘和开发已取得众多进展,但它们在植物中的应用仍然有限。加速这些工程化的效应器在植物系统中应用,对于拓宽植物基因编辑工具包至关重要。通过对多个氨基酸突变产生的成功案例的分析,以及在蛋白质3D结构和平面结构中进行关键氨基酸的标注,发现Type V效应子的修饰主要集中在DNA/RNA结合域,这些氨基酸通常位于DNA/RNA分子的几个?(?ngstr?ms)内(图3)。这为未来效应器工程和核酸酶定向进化提供了宝贵的见解。

 V型效应器工程改造的现状

图3.A. AsCas12a 的工程化改造 B. LbCas12 的工程化改造

 C. Cas12c 的工程化改造 D. Cas12f 的工程化改造

 E. Cas12i 的工程化改造 某些氨基酸无法在 PDB 数据库的蛋白质模型中显示

  除了结构和分类上详细的总结,该综述还重点总结了Type V效应器在植物和动物中的多种应用的现状,包括它们作为碱基编辑器(BE)、调节基因表达的工具、基因打靶(GT)和生物传感器(图4)。

图4. Type V 型效应器的生物学应用。

A. Type V效应子(Cas12蛋白)和Cas9蛋白之间的差异  B. 基于Cas12的碱基编辑工具原理 

C.基于Cas12的基因表达调控原理  D. CRISPR 相关转座酶 (CASTs) 的原理

 E. 基于 Cas12 的植物生物传感器

  Type V效应器应用的优势总结如下:1)单个RuvC核酸酶结构域产生的粘端DSB特别有利于产生基于HDR的修复,从而提高植物中的精确基因打靶效率;2)蛋白的结构更紧凑,尺寸更。欣诓煌δ茉的融合与优化,以及基于病毒的转化与递送;3)Cas12效应子的顺式和反式切割能力,更利于高效生物传感器的开发;(4)部分V型效应子(如Cas12a、i、j、m)不需要tracrRNA,有利于crRNA的组装,实现植物中的多基因编辑。

  综上,深度学习和从头蛋白质设计的整合在加速 Cas 效应系统的开发方面具有巨大的前景,并有助于创建具有增强功能的基因操作工具。与针对几个关键氨基酸突变相比,对Cas12的关键肽段或三维结构进行更精细的优化或重新设计可以实现更大、更精确的调整。这种方法通常需要更强大的预测和计算能力。利用人工智能辅助设计代表了一个非常有前途方向。此外,Cas12家族成员相对保守但功能多样且结构紧凑,有利于目标蛋白的从头设计。鉴于基因编辑在修改遗传565体育方面的重要意义,Cas12 具有成为未来蛋白质设计和工程化改造与应用平台的巨大潜力。

  博士生张瑞祥,博士后柴楠为该论文的共同第一作者,祝钦泷研究员与刘耀光院士为论文的共同通讯作者。林秋鹏教授和谢先荣副研究员参与了论文的讨论。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、广东省基础与应用基础研究重大项目和广东省“十四五”农业科技创新十大重点项目的资助。 

  相关论文565体育:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975024000764


文图/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室

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